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荧光光度法测定阿司匹林中乙酰水杨酸的含量

一、实验目的

1.掌握用荧光法测定药物中的乙酰水杨酸含量的方法。 2.掌握970CRT型荧光分光光度计的操作方法。 3.加深对荧光光度法原理的理解。 二、实验原理

1.荧光光度法原理

（1）常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。在稀溶液中，当实验条件一定时，荧光强度IF与物质的浓度c成线性关系：

即IF?Kc（这是荧光光谱法定量分析的理论依据）。 （2）荧光光谱

荧光强度

激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与照射光波长的

关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。

发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。

固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择是本实

1

波长

验的关键。

2. 荧光光度法测定阿司匹林中乙酰水杨酸的含量

通常称为ASA的乙酰水杨酸（阿司匹林）水解即生成水杨酸（SA）（如下式）。而在阿司匹林中或多或少存在一些水杨酸，用醋酸―氯仿作为溶剂，然后用荧光法可以分别测定其含量，少许醋酸还可以增加二者的荧光强度（本次实验只测定阿司匹林中乙酰水杨酸的含量）。在1%的乙酸―氯仿中乙酰水杨酸的激发光谱和荧光光谱如图所示：（为了消除药片之间的差异，可以取几片一起研磨，然后取部分由代表性的样品进行分析）

(CH3CO)2O (SA)

H2O

三、仪器与试剂：

(ASA)

仪器：970CRT型荧光分光光度计及附件；容量瓶：1000mL 2只，100 mL 2只，50mL 8只；l0mL吸管2支；铁架台；研钵；称量瓶；玻璃棒；烧杯；定量滤纸；电子天平。 试剂：冰醋酸；氯仿；乙酰水杨酸；阿司匹林；丙酮。 四、实验步骤：

1. 接通电源，打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初始化仪器，预热30min左右。

2. 仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数。 3.配置溶液：

（1）配置1%的醋酸―氯仿溶剂：在1000ml容量瓶中，将冰醋酸与氯仿以1:99的比例配制。

（2）配置储备液：准确称取0.4000g乙酰水杨酸溶于1%的醋酸―氯仿溶剂中制成溶液，在1000ml的容量瓶中定容备用。（400ug|ml）

（3）配置4.00 ug|ml的ASA溶液：在100 ml容量瓶中将（2）中的标准液稀释100倍.(扫光谱)

（4）配绘制标准曲线的ASA标准系列溶液:在5只50ml的容量瓶中用吸管分别吸取（3）中的溶液为1ml；l4ml；10ml；15ml；25ml，再用1%的醋酸―氯仿溶剂稀释至刻度，计算出浓度分别是：0.08ug|ml；0.32ug|ml；0.80ug|ml；1.20ug|ml；2.00ug|ml，贴上标签。

2

4.绘制ASA的激发光谱和发射光谱：

用（3）中的溶液即4.00 ug|ml的ASA溶液分别绘制ASA的激发光谱和发射光谱，并且分别找出它们的最大激发波长（Ex）和最大发射波长（Em）。 5.测定系列标准溶液的荧光强度：

将（4）中的溶液即配绘制标准曲线的ASA标准溶液在相应的找出Ex和 Em下分别测定其荧光强度，测定三次，求平均值。 6. 配置待测溶液：

取7片阿司匹林药片研磨成粉，称取0.4000g用1%的醋酸―氯仿溶剂溶解，全部转移到100ml的容量瓶中，再用1%的醋酸―氯仿溶剂稀释至刻度，迅速用定量滤纸过滤，将此滤液稀释1000倍（三次稀释完成）。 7. 测定待测液中ASA的荧光强度：

用测定标准系列时相同的条件，平行测量其荧光强度3次。 8.退出主程序，关闭计算机，先关主机电源，最后关氙灯。 五、实验结果的记录及数据处理 1. 标准系列溶液的荧光强度:

荧光强度(I) 浓度(μg/ml) 1 0.08 0.32 0.80 1.20 2.00 2 3 平均 RSD 2.用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线: 以浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。 3.待测溶液荧光强度的测定与数据记录：

称取阿司匹林肠溶片粉末0.4000g

次数 荧光强度（I） 浓度/μg.ml-1 1 2 3 平均值 RSD 根据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度。

3

4.计算出阿司匹林乙酰水杨酸的含量（乙酰水杨酸的百分含量）。 六、实验应注意事项

1.使用970CRT时，要按照仪器使用规定使用，不可随意操作。 2.使用比色皿时，要注意勿用手直接触摸比色皿表面，因握住侧棱。 3. 阿司匹林药片溶解后，1h内要完成测定，否则ASA的量将降低。 七、思考题

1、标准曲线是直线吗？若不是，从何处开始弯曲？并解释原因。

答：标准曲线不是直线。在浓度大于1.0 ug|ml时开始弯曲。因为在稀溶液中即浓度小于10 -6g.ml-1（小于1.0 ug|ml），当实验条件一定时，荧光强度IF与物质的浓度c才成线性关系：即IF?Kc。

2、本实验中如果仪器潮湿对实验结果又怎样的影响？

答：有水分时乙酰水杨酸（ASA）水解即生成水杨酸（SA）,导致实验结果偏小。

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丹麦耳酷灵听力测试仪的操作流程 丹麦听力筛查仪有哪些品牌

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